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    PC抽提/醇沉淀方法

    PC(P是英文酚的缩写,C是英文氯仿的缩写)抽提/醇沉淀方法方便、经济、可靠、稳定,是一个永不过时的方法。PC抽提能够将蛋白质彻底去除,盐能够将醇沉淀,对于一般的干净的样品(杂质为蛋白质),高质量的核酸完全能够通过此方法而获得。尽管每次PC抽提均会有一部分核酸(因为不可能将水相全部移取)损失,以及低浓度核酸的醇有着很低的沉淀效率,然而通过调整操作能够将这些问题的影响减少甚至解决。不适合大规模抽提是此方法最大的问题。


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    去除蛋白质的一个非常有效的手段即是PC抽提,苯酚可以使蛋白质变性,从水相中能够析出变性后的蛋白质,在苯酚/水相之间或者苯酚中存在。用量充足以及彻底混匀为PC抽提的关键。只有彻底混匀,才可以使苯酚与蛋白质的充分接触得以确保,使蛋白质完全变性。不需要担心混匀的剧烈程度会对核酸,特别是基因组DNA造成破坏。剧烈的混匀操作,是会使大分子的基因组DNA被部分打断,然而该破坏作用不会强烈到DNA变成10kb以内的小片段。手剧烈晃动混匀后,大多数基因组DNA的片段均会超过20kb,除了一些特别的要求外,这个大小是完全适用于PCR和酶切。


    如果要求非常大的片段,剧烈的混匀方法就不能够使用。而只能来回温和颠倒混匀。裂解液要有足够大的比例,使体系不要太粘稠是此事的关键。之所以要有充足的用量,是因为苯酚去除蛋白质是有一定的饱和度的。若超过了该饱和度,那么就不能一次去除裂解体系中的蛋白质,必须通过多次抽提,才能够去除彻底。


    除此以外,体系太粘稠的的缺点是很难彻底去除蛋白质,并且基因组DNA会断裂得更加严重,因此需要对裂解液与样品的比例加以注意。4℃离心操作对于蛋白质彻底去除更加的有利。利用酸性酚能够将DNA部分去除的特点。在RNA抽提时获得DNA残留极少的RNA。值得注意的是,某些植物样品,在将某些杂质去除以前,PC抽提是不能使用的,不然一定会使核酸降解。


    2019-08-16 17:48:54 浏览次数:81次

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